在進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)過程中，影響限制性酶切反應(yīng)效果的因素較多，要設(shè)計(jì)酶切反應(yīng)，一般均應(yīng)考慮諸如酶切系統(tǒng)、溫度條件、反應(yīng)體積、底物性質(zhì)及星型反應(yīng)等因素。根據(jù)各種不同的條件，酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)一般應(yīng)注意以下問題：
         1. 大多數(shù)限制酶貯存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)*終反應(yīng)液中甘油濃度大于12％時(shí)，某些限制酶的識(shí)別特異性降低，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會(huì)抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影響。
         2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶失活，用水稀釋的酶不能長期保存。
         3. 反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子，當(dāng)用其它二價(jià)陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時(shí)，酶活性會(huì)被抑制，或改變酶的特異性，導(dǎo)致星型反應(yīng)。
         4. 多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：①非*適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機(jī)溶劑的存在。
         5. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會(huì)形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。
         6. 酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中，根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對(duì)不同的限制酶，各廠家均有一的消化量指標(biāo)可參考。
         7. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí)，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時(shí)切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：
         ①先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶，繼續(xù)反應(yīng)；
         ②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。
          8. 用同一種酶切割不同的DNA時(shí)，所需酶量不同，可根據(jù)DNA底物上酶切位點(diǎn)的多少與λDNA存在位點(diǎn)的數(shù)目比較后，決定用酶量。對(duì)于超螺旋DNA，基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA，使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大。
         9. 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。
        10.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。
        11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個(gè)重要因素，所以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。
       12.要保證酶作用時(shí)的*佳反應(yīng)條件（ph, 溫度）和底物用量，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。
       13.反應(yīng)取酶時(shí)應(yīng)使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時(shí)應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時(shí)間。
       14.高于37℃或需長時(shí)間保溫時(shí)，可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。
       15.反應(yīng)混合物混勻時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。
       16.反應(yīng)前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
       17.用已硅化的離心管進(jìn)行酶切反應(yīng)，可獲得更佳的酶切效果，否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。
       18.終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進(jìn)一步反應(yīng)（如連接，切割等），可將反應(yīng)管置65℃保溫20-30分鐘，以滅活酶終止反應(yīng)。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作。
       19. 不同廠家的試劑不可混用，需要時(shí)請(qǐng)查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。
二、限制性酶解中常見的問題及解決措施：
       限制性酶切割DNA底物的操作過程中，會(huì)出現(xiàn)一些問題，產(chǎn)生的原因主要為酶解體系中各要素處于非*佳狀態(tài)，包括DNA的純度和特性，反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)體積、反應(yīng)時(shí)間及溫度等。

酶切反應(yīng)的注意點(diǎn)：

   1  20ul體系是*佳體系

   2  20ul體系*多切2ug的DNA

   3  甘油的量是低于體系的5%，不超過10%

   4  酶切效率和酶的質(zhì)量，保護(hù)堿基，酶切位點(diǎn)的位置（同一段DNA不同位置可以差很遠(yuǎn)，就算是都在中間也是一樣的），酶切位點(diǎn)狀態(tài)（如位點(diǎn)及周圍幾個(gè)堿基是否被甲基化等，有些甲基化后切不開，有些恰好相反。DAN的空間結(jié)構(gòu)、識(shí)別序列的側(cè)翼序列、DNA來源也有影響）酶的量，DNA的量，體系的純凈度（比如雜質(zhì)的干擾，很多雜質(zhì)如乙醇等可以明顯抑制酶活性,另外還有DNase，蛋白質(zhì)，EDTA，SDS，鹽離子，酚氯仿），buffer的選擇，是否加BSA,DNA 的狀態(tài)（比如超螺旋狀態(tài)DNA酶切效率低5倍－－這也是不能1ug質(zhì)粒用1u酶切的原因，也不能只切1h的原因），星號(hào)活力等（也是因?yàn)殡s質(zhì)干擾或者甘油太多，buffer不合適，酶活性不穩(wěn)定）

   5  一般不好的酶需要8倍的酶量，切2－4h。如果是比較好的酶可以4倍酶量切2－4h，甚至可以一倍酶量切10h以上。 做的不好的酶一來有雜質(zhì)酶污染，切久了污染的酶產(chǎn)生的影響會(huì)很明顯，相對(duì)的酶量用大些引起的雜質(zhì)酶切割問題要小些，所以采用大酶量短時(shí)間。 二來不好的酶不穩(wěn)定，時(shí)間長了識(shí)別位點(diǎn)會(huì)發(fā)生變化，造成亂切的情況。所以采用了大酶量短時(shí)間的方法，雖然有些浪費(fèi)。 而比較好的酶則相反。

注意酶加BSA目的一可以穩(wěn)定酶，低濃度酶容易降解。二可以減少管臂對(duì)酶非特異吸附。

用孵箱不要用水浴箱，因?yàn)閲�產(chǎn)貨不穩(wěn)一不小心就39去了，對(duì)酶活性殺傷較大，孵箱至少不會(huì)突然很熱了。www.zhelie3.cn

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