分離純化的基本原理 ：

研究基因的表達和調控時常常要從組織和細胞中分離和純化RNA。RNA質量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。

     TRIzol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，適用于從細胞和組織中快速分離RNA。內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。TRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，特點是可同時分離一個樣品的RNA\\DNA\\蛋白質.TRIzol使樣品勻漿化，細胞裂解，溶解細胞內含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質。

操作步驟：

1. 勻漿處理：
a.組織處理  將文蛤的各個組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞　直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA受到DNA的污染。
c.細胞懸液離心收集細胞，每5～10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1mlTRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2.將勻漿樣品在室溫（15～30℃）放置5min，使核酸蛋白復合物完全分離。

3.由于樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質，因此在2～8℃10000rpm離心1min，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3分鐘。

5. 2-8℃10000rpm離心15min。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min。

7. 2～8℃10000rpm離心10min，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超過7500rpm離心5min，棄上清。

9.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5～10min即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55～60℃放置10分鐘使RNA溶解。RNA可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

10.瓊脂糖凝膠電泳對提取RNA產物進行檢測。

原創作者：上海恒遠生物技術發展有限公司